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　　2、104 代理人 韦锦捷 (54) 发明名称 一种产羧甲基纤维素酶的 Achromobacter xylosoxidans 菌株 (57) 摘要 本发明公开了一种从堆肥中分离筛选出来的 能产纤维素酶的细菌 7B， 保藏于中国典型培养物 保藏中心， 保藏编号为 CCTCC NO:M2013365。菌 株 7B 为革兰氏阴性杆菌， 在 LB 培养基上形成直 径为 0.5 1mm， 光滑、 湿润、 有光泽、 灰白色、 边 缘整齐的菌落。采用 BIOLOG 微生物鉴定系统和 16s rDNA 序列分析鉴定该菌株为 Achromobacter xylosoxidans。 采用CMC发酵培养基进行培养， 可

　　4、romobacter xylosoxidans)7B 在发酵生 产羧甲基纤维素酶、 制备降解纤维素的生物酶制剂以及降解水体污染物上的应用。 3. 根据权利要求 2 所述的应用， 其特征在于， 所述的水体污染物为乙苯、 亚氨基二琥珀 酸、 硫丹以及工业 COD。 4. 根据权利要求 2 所述的应用， 其特征在于， 所述的发酵生产羧甲基纤维素酶包括酸 性羧甲基纤维素酶和碱性羧甲基纤维素酶。 5. 根据权利要求 4 所述的应用， 其特征在于， 所述的酸性羧甲基纤维素酶的作用 pH 为 4.0 ； 所述的碱性羧甲基纤维素酶的作用 pH 为 8.6。 6. 根据权利要求 4 所述的应用， 其特征在于，

　　5、所述的碱性羧甲基纤维素酶的反应温度 为 60。 权 利 要 求 书 CN 104232522 A 2 1/5 页 3 一种产羧甲基纤维素酶的 Achromobacter xylosoxidans 菌株 技术领域 0001 本发明属于生物工程技术领域， 特别涉及从牛粪堆肥样品中筛选、 分离、 纯化、 得 到的能产纤维素酶的木糖氧化无色杆菌 Achromobacter xylosoxidans7B。 背景技术 0002 进入 21 世纪后， 随着化石燃料的前景趋向枯竭、 碳排放过量、 环境污染和生态失 衡等问题凸显， 人们越来越将目光投向可再生的清洁新能源。 木质纤维素， 即是其中一种优 良的资源

　　6、。利用木质纤维素生产燃料乙醇成为一种极具潜力的清洁能源技术。木质纤维素 在农业生产中储量丰富， 但价值未得到深度发掘。据估计， 全球纤维素生产量为 6600-8800 亿吨 / 年。我国作为农业大国， 每年也产生大量的木质纤维素。可见， 木质纤维素开发利用 前景极其广阔。 0003 木质纤维素的瓶颈之一就是廉价、 高品质生物酶的缺乏。木质纤维素的主要成分 包含纤维素、 半纤维素和木质素， 同时还可能含有少量的果胶、 几丁质、 硅酸盐等成分。其 中， 纤维素占比约为 35-45， 为一类由葡萄糖分子通过 -1,4 糖苷键连接形成的线状多 聚葡萄糖。可以经由外切葡聚糖酶、 内切葡聚糖酶 (endo

　　7、-1,4-glucanase， EC3.2.1.4) 和-1,4-葡萄糖苷酶(-1,4-glucosidase， EC3.2.1.21)的连续作用而降解成容易被应 用发酵工业的单分子葡萄糖。挖掘在温和条件下将其水解的生物酶制剂， 无论是对该资源 的开发， 还是对纤维素加工产业 ( 纺织、 造纸等 ) 的技术改进， 具有重要意义。纤维素酶可 以按作用的最适 pH 条件划分为酸性纤维素酶和碱性纤维素酶。酸性纤维素酶指作用的最 佳 pH 条件在酸性范围的一类纤维素水解酶， 目前发现的主要由一些丝状真菌， 如木霉、 根 霉等微生物产生， 主要用于纤维素资源开发研究、 饲料工业， 以及纺织工业对棉料的表

　　8、面处 理。此类纤维素酶在商业化酶中占多数。 0004 而碱性纤维素酶则指在碱性条件下能够催化裂解纤维素分子的一类水解 酶。目前的研究表明， 该类纤维素酶一般只有纤维素内切酶， 即内切 -1,4 葡聚糖酶 (endo-1,4-glucanase， EC3.2.1.4， 简称内切酶， EG 或 BGL) 的活性， 活力用羧甲基纤维 素(CMC)为底物测定， 为此也 称之为羧甲基纤维素酶(CMCase)。 由于碱性纤维素酶的作用 pH 在碱性范围内， 与纺织物洗涤条件比较一致， 能够在温和条件下作用于污渍附着的位点， 却不会对衣物造成损害， 所以， 该酶类产品目前主要用于洗涤工业， 为加酶洗涤产品的

　　9、必需 原料。至今为止， 能够产生碱性纤维素酶的微生物多为细菌菌株， 包括芽孢梭菌属、 纤维单 胞菌属、 纤维弧菌属、 混合纤维弧菌、 芽孢杆菌属等的一些菌种， 以及牛黄瘤胃梭菌、 白色瘤 胃球菌、 溶纤维菌， 热纤梭菌、 解纤维梭菌、 粪碱纤维单胞菌等菌种， 国外该类酶的工业化生 产主要以芽孢杆菌属的菌株 ( 如 Bacillus sp.KSM-635) 为发酵菌种。国内的研究受制于 缺乏碱性纤维素酶的高产菌株， 鲜有大规模的发酵生产， 挖掘新的微生物产纤维素酶菌株 仍极为必要。 0005 更为重要的是， 生产中缺乏既有生产效益又具有环保附加效益的碱性纤维素酶生 说 明 书 CN 104232

　　10、522 A 3 2/5 页 4 产菌株， 可以在降解纤维素的同时， 实现环境污染物的降解。为此， 我们进行了一系列天然 菌株的筛选工作。 发明内容 0006 本发明的目的是从自然环境中分离筛选出一株新的产纤维素酶、 具有一定环保效 益的细菌菌株。 0007 本发明提供的菌株是从堆肥中样品中分离得到一株具有纤维素酶生产能力的细 菌 7B。经鉴定， 该菌株属于木糖氧化无色杆菌 (Achromobacter xylosoxidans)， 因而分类 命名为 Achromobacter xylosoxidans 7B。申请人于 2013 年 8 月 8 日将其保藏于湖北省武 汉市武汉大学内的中国典培养物

　　11、保藏中心 CCTCC ， 编号为 ： CCTCC NO ： M2013365。 0008 本 发 明 除 了 要 求 保 护 上 述 的 木 糖 氧 化 无 色 杆 菌 (Achromobacter xylosoxidans)7B 菌株外， 还要求保护其在发酵生产羧甲基纤维素酶、 制备降解纤维素的生 物酶制剂以及降解水体污染物上的应用。 0009 所述的发酵生产羧甲基纤维素酶包括酸性羧甲基纤维素酶和碱性羧甲基纤维素 酶。 0010 所述的发酵生产羧甲基纤维素酶产量最大的条件为 ： 温度 37， 200rpm 下摇瓶培 养约 60h。 0011 所述的发酵生产酸性羧甲基纤维素酶的最适作用 pH

　　12、为 4.0 ； 所述的发酵生产碱性 羧甲基纤维素酶的最适作用 pH 为 8.6。 0012 所述的碱性羧甲基纤维素酶的最适反应温度为 60。 0013 所述的水体污染物为乙苯、 亚氨基二琥珀酸、 硫丹以及工业 COD。 0014 本发明具有的突出的实质性特点和显著的进步是 ： 0015 本申请人从自然界中成功分离筛选出了一种未报道的能产纤维素酶的新菌株， 拓 宽了纤维素酶生产菌株的选择范围， 有利于推进木质纤维素降解利用中纤维素酶的进一 步优化。本发明所提供的菌株为好氧的短杆状革兰氏阳性菌， 在 LB 培养基上形成直径为 0.5-1mm， 光滑、 湿润、 有光泽、 灰白色、 边缘整齐的菌落。

　　13、经实验证明， 该菌株在有氧条件下， pH 8， 培养温度为 30时生长最快。在最适产酶条件下最高酶活可达 0.183U/mL， 且主要 呈现酸性纤维素酶活力。酸性 CMC 酶的最适作用 pH 为 4.0， 碱性 CMC 酶的最适作用 pH 为 8.6。碱性 CMC 酶活力为酸性 CMC 酶活力的 70。所述的菌株对 BTEX、 IDS 和硫丹的降解 效率在 70以上。 附图说明 0016 图1为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)7B CCTCC NO ： M2013365 最适生长 pH 的测定结果。其中， 培养基采用 LB 培养基 ； 培养条件 ： 有氧

　　19、3365 对污染物的降解能力测定结果。EB ： 乙苯 ； IDS ： 亚氨基二琥珀酸 ； ED ： 硫丹。 具体实施方式 0025 实施例 1 菌株筛选、 分离与鉴定 0026 第一步 ： 采样 0027 广西壮族自治区南宁市武鸣县郊堆肥样品。 0028 第二步 ： 初筛、 复筛及纯化 0029 取样品 1g， 加 10ml 无菌蒸馏水， 充分振摇， 静止 30 分钟， 取上清液稀释 105倍， 涂 布接种 CMC- 刚果红平板筛选培养基， 30培养 72h 至菌落长出， 挑取透明水解圈较大的菌 落， 接种 CMC 液体发酵培养基， 37， 200rpm 摇瓶培养 24h， 测定培养液的碱性

　　20、CMC 酶活力。 选取活力最高的培养瓶， 取菌液划线接种CMC-刚果红平板筛选培养基培养， 纯化菌株3次， 最后得到 1 株产碱性纤维素酶的高产菌株， 命名为 7B， 斜面和冷冻干燥保藏。 0030 第三步 ： 菌种鉴定 0031 形态观察。 LB培养基培养的菌体用革兰氏染色法进行显微观察， 可见菌株7B为革 兰氏阴性杆菌。在 LB 培养基上形成直径为 0.5-1mm， 光滑、 湿润、 有光泽、 灰白色、 边缘整齐 的菌落。如图 1 和图 2 所示， 菌株在有氧条件下， pH 8， 培养温度为 30时生长最快。如 说 明 书 CN 104232522 A 5 4/5 页 6 图 3 所示， 菌

　　21、株在 LB 培养基中生长迅速， 在约 12h 即结束对数期， 60h OD600达到 1.5， 且在 120h 之内菌数不明显下降。 0032 BIOLOG 微生物鉴定系统的鉴定。用 Biolog 微生物鉴定系统进行。活化的菌株接 种 BUG 培养基， 接种量 5， 33， 200rpm 培养 24-48h， 调整菌液浊度至 5， 将菌液加入仪 器的 GENIII96 孔生化鉴定板， 利用仪器的 MicroStation 读取鉴定板中各孔的颜色反应特 征值， 通 过ML3DC分析程序与数据库中细菌的生理生化数据进行匹配， 根据7B菌株与数据 库菌株之间匹配的概率、 相似性和位距对 7B 菌株进

　　29、2+、 Mn2+、 Ca2+3 种离子对酶活 有促进， Co2+和 Mn2+分别使酶活力提高 6.7和 7.1。K+、 Mg2+和 Ni+3 种离子对酶活力稍 有抑制， K+和 Ni+加入酶反应体系后分别使酶活力降低了 4.7、 4.4。Fe2+和 Na+对酶的 活力几乎没有影响。而 Cu2+对菌株所产碱性 CMC 酶具有明显的抑制作用， 使酶活力显著降 低了 46。 0040 实施例 3 对 BTEX 和难降解螯合剂的处理 0041 本实施例在实验室水平进行。采用 2 CMC 纤维素的 10 倍稀释 LB 培养基模拟富 含有机质的污水水体。分别以 ： 添加 0.02的乙苯模拟 BTEX 污染

　　30、的工业废水 ； 添加 0.1 IDS( 亚氨基二琥珀酸 ) 模拟难降解螯合剂污染水体 ； 添加 0.1的硫丹模拟难降解农药污 染水体。实验采用 100mL 培养液， 接种量 1， 30， 转速 180rmp 摇瓶培养 48 小时。每 4 小 时采样检测残留 COD 与污染物。其中， 乙苯残留量的测定采用正己烷萃取 + 气象色谱分析 法， 其中色谱柱为 HP-Innoax 毛细管柱， 柱温 90， 柱流量 1mL/min， 载气为 N2； COD 测定采 用重铬酸钾氧化法 ； IDS 残留测定采用 350nm 分光光度法。硫丹残留采用硫丹酶联免疫检 测试剂盒 ( 天津生物新品技术公司 ) 测定。